Network Toscana Life Sciences: Single Item

• In particolare nel laboratorio di Neurochimica vengono allestiti modelli sperimentali che permettano lo studio specifico a) del legame tra ligandi (sostanze naturali o di sintesi) e singoli recettori implicati nella neurotrasmissione, b) dell' attivazione dei meccanismi cellulari di trasduzione del segnale c) della risposta della cellula in seguito a segnali vita/morte.
• Nel laboratorio di Farmacologia vengono effettuati a) studi  farmacologici funzionali in vitro e in vivo e di biologia molecolare nel settore vascolare, b) la valutazione di modulatori del canale del potassio e NO-donatori ; del dimorfismo sessuale nelle risposte cardiovascolari, del rapporto struttura-attività di nuovi composti sintetici o composti di origine naturale: potenziali attivatori dei canali del potassio, ibridi NO-donatori/antagonisti dell'angiotensina II. Viene inoltre valutata la cardiotossicità torsadogenica dei farmaci in vitro , in vivo e in silico e il ruolo di neuromodulatori e dei relativi recettori sulle funzioni neuromotorie delle vie respiratorie in modelli normali e patologici. Viene inoltre eseguito lo screening bioguidato di piante medicinali: valutazione farmacologica delle proprietà cardiovascolari di  estratti grezzi e principi attivi di entità vegetali  e identificazione del meccanismo di azione.
• Nel laboratorio di Fisiologia attualmente vengono studiate le proprietà strutturali e funzionali dei canali ionici in neuroni retinici di animali normali e mutanti. Gli obiettivi di questi studi comprendono: la spiegazione a livello molecolare e cellulare  dei meccanismi di elaborazione dell'informazione visiva (analisi temporale e spaziale degli stimoli luminosi), la individuazione dei bersagli  molecolari e cellulari  di varie forme di degenerazione retinica (mediante l'uso di modelli animale di retinite pigmentosa , degenerazione maculare , Sindrome di Leber); vengono inoltre studiati i  meccanismi molecolari e cellulari  di molecole dotate di attività farmacologica i meccanismi di neuroprotezione retinica con particolare riguardo ai fattori trofici e agli antagonisti del glutammato.

• Nel corso degli anni nel laboratorio di Neurochimica è stata acquisita esperienza nello studio dei recettori centrale (CBR) e periferico (PBR) delle benzodiazepine, recettori accoppiati a proteine G quali i recettori per l'adenosina, la dopamina, l'adrenalina, la serotonina mediante approcci sperimentali di vario tipo, quali la solubilizzazione e la purificazione dei recettori, la modificazione chimica di specifici siti di legame e la valutazione dell'attività di composti di nuova sintesi. Inoltre, nel laboratorio sono stati condotti studi tesi alla caratterizzazione del PBR in isole pancreatiche isolate da pancreas umano, di ratto o di maiale e alla  valutazione del legame di ligandi alla retina di coniglio, analizzando inoltre la distribuzione del recettore stesso mediante tecniche autoradiografiche. Ulteriore interesse è stata anche la valutazione delle alterazioni del PBR in relazione a condizioni patologiche diverse, quali il panico, la depressione, o i disordini ossessivo-compulsivi, il morbo di Parkinson, alterazioni senili, stress sonoro e malattie mitocondriali. Più recentemente nel laboratorio è stata acquisita esperienza nello studio dei fenomeni di morte cellulare, valutando nel tessuto cardiaco l'induzione della transizione della membrana mitocondriale e della apoptosi da parte di ligandi al PBR, l'espressione del PBR in isole pancreatiche umane esposte all'azione di citochine infiammatorie, un modello utilizzato nello studio del diabete di tipo I Sono state inoltre  messe a punto metodiche atte allo studio dei meccanismi di regolazione dei recettori adenosinici su cellule del sangue e su linee cellulari transfettate  e tumorali. In particolare, sono stati valutati ii processi di desensitizzazione, internalizzazione e down-regulation e il ruolo delle vie fosforilative intracellulari nella regolazione di tali recettori. Le esperienze sono state estese anche allo studio dei meccanismi di  regolazione eterologa del recettore A2A dell'adenosina da parte di citochine proinfiammatorie in cellule PC 12 e di astrocitoma umano e lo studio del ruolo del sistema dell'adenosina e delle citochine nel controllo dei processi di vita/morte della cellula in linee cellulari neuronali). Il  laboratorio ha acquisito esperienza sul trasportatore della serotonina (SERT) attraverso approcci quali il binding, la solubilizzazione e la purificazione, studi cinetici con particolare riferimento alle sue implicazioni nelle patologie psichiatriche e nell'obesità.
• Il Laboratorio di Farmacologia ha svolto attività nel campo della modulazione farmacologica nelle patologie del tratto respiratorio, relativamente ai sistemi di controllo neuromotori. Sono stati effettuati studi su modelli sperimentali in vitro ed in vivo, quali trachea e bronchi isolati, in condizioni in assenza ed in presenza di elettrostimolazione e sono stati condotte ricerche sul ruolo dei recettori purinergici, colinergici, cannabinoidi e di mediatori del sistema NANC e nella modulazione della funzione respiratoria in condizioni normali e in modelli patologici quali la sensibilizzazione allergica e la risposta acuta alla somministrazione di un antigene. E' stato inoltre affrontato lo studio del ruolo degli isoenzimi della ciclossigenasi nella modulazione della responsività delle vie aeree e del cross-talk tra il sistema delle cicloossigenasi e dell' NO, in condizioni normali e patologiche. Per quanto concerne la farmacologia cardiovascolare, è stata condotta attività sperimentale mirata alla definizione del ruolo fisiopatologico dell'ossido d'azoto (NO) endoteliale e allo studio di nuovi farmaci eterobifunzionali, antagonisti dei recettori A1 dell'angiotensina II e NO-donatori. La caratterizzazione farmacologica si è avvalsa di metodiche in vivo e in vitro, finalizzate alla valutazione dei parametri di efficacia antiipertensiva, di attività vasomotoria, di effetti cardioprotettivi anti-ischemici, e di azioni sull'aggregazione piastrinica.
• Le stesse metodiche sperimentali sono state utilizzate anche per la valutazione delle potenziali basi razionali farmacodinamiche per l'utilizzo di farmaci attivatori di diversi sottotipi di canali del potassio nonché per la caratterizzazione farmacologica di molecole di nuova sintesi o di origine naturale, potenzialmente attive su questi canali ionici. Metodiche di valutazione farmacologica in vivo e in vitro sono state inoltre messe a punto e indirizzate allo studio della potenziale cardiotossicità iatrogena di farmaci appartenenti a svariate classi terapeutiche, in grado di interagire con canali ionici cardiaci e indurre, attraverso un ritardo del processo di ripolarizzazione, aritmie ventricolari polimorfe del tipo torsade de pointes. Tali tecniche, accoppiate a opportuni modelli chimico-computazionali, hanno inoltre consentito di raggiungere incoraggianti risultati nello sviluppo di modelli teorici in grado di correlare ad una data struttura chimica una potenziale interazione con la ripolarizzazione cardiaca e dunque di predire la potenziale insorgenza di tale tipo di cardiotossicità. Sono state messe a punto metodiche per lo studio di espressione di recettori e canali di membrana, tramite RT-PCR; in particolare sono stati studiati recettori per l'adenosina e per i cannabinoidi e i canali per il potassio a grande conduttanza (BK) di cui sono state studiate a livello vascolare le varianti di splicing relative alle subunità alfa e beta. Sono state inoltre acquisite tecniche per la valutazione della vitalità cellulare e dell'apoptosi in cellule tumorali e non. Infine vengono applicate tecniche di PCR e di fingerprinting del DNA, quali RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e SCAR (Sequenze Characterized Amplified Region) nello studio e riconoscimento di piante medicinali.
• Nel Laboratorio di Fisiologia  vengono da molti anni condotti studi sui meccanismi molecolari e cellulari che sono alla base del funzionamento dei  neuroni retinici. Le principali tematiche che sono state affrontate negli ultimi anni, mediante l'uso di metodiche elettrofisiologiche, morfologiche, immunoistochimiche e  molecolari, sono centrate  sui meccanismi di trasduzione del segnale con particolare riguardo alla regolazione della fototrasduzione nei recettori retinici. E' stata inoltre acquisita una notevole esperienza nello studio a) della struttura molecolare e della funzione dei canali ionici presenti nei diversi tipi di neuroni retinici con particolare riguardo per i canali HCN, di sui sono state individuate le varie isoforme e il loro significato funzionale nella elaborazione dell'informazione sensoriale. b) delle proprietà di meccanismi di trasporto attivo attraverso la membrana delle cellule visive ed in modo particolare della ATPasi Na/K  e dello scambiatore Na,K/Ca. Per quanto riguarda la ATPasi, è stato dimostrato che essa ha un ruolo centrale nei processi di adattamento alla luce delle cellule visive. Per quanto riguarda  lo scambiatore, ne è stata determinata per la prima volta la stechiometria che inaspettatamente è risultata essere 4Na, 1K/1Ca, con importanti implicazioni funzionali. c) E' stata infine sviluppata una tecnica di stimolazione, registrazione ed analisi dei dati che ha permesso di correlare  registrazioni non invasive dell'attività elettrica retinica (elettroretinogramma) con il funzionamento dei vari tipi di neuroni retinici . Questo tipo di analisi si è rivelato molto efficace per individuare i meccanismi cellulari e molecolari di sostanze ad azione farmacologica su neuroni centrali in animali intatti.

•  Disponibilità delle seguenti colture cellulari:

1. cellule DTT1-MF2 (muscolo liscio di ratto),
2. Cellule PC 12 (feocromocitoma di ratto),
3. Cellule HG-C2 (cardiomioblasti di ratto),
4. Cellule CHO transfettate con i recettori umani A1, A2A e A3 dell'adenosina.
5. Cellule ADF (astroglioma umano),
6. Cellule C6 (glioma di ratto),
7. Cellule BAEC (cellule endoteliali di aorta bovina),
8. Cellule HEK transfettate con diverse subunità del recettore centrale delle benzodiazepine (a₁b₂g₂, a₂b₂g₂, a₃b₂g₂, a₅b₂g₂),
9. Cellule MIA PaCa2 (carcinoma pancreatico umano),
10. Cellule SH-SY5Y (neuroblastoma umano),
11. Cellule MCF-7 (tumore mammario umano),
12. Cellule HK-2 (tubulo prossimale renale umano).

• Saggi biologici per la valutazione dell'attività di composti di nuova sintesi quali potenziali farmaci. In particolare la nostra Università di saggi biologici di binding con radioligandi per i seguenti sottotipi recettoriali:

1. recettori benzodiazepinici centrali e periferici,
2. recettori adenosinici,
3. recettori serotoninergici e trasportatore della serotonina,
4. recettori dopaminergici,
5. recettori adrenergici,
6. recettori per l'endoteline.

• Saggi funzionali in vitro ed in vivo per lo studio di farmaci ed estratti di piante medicinali attivi sul sistema respiratorio, cardiovascolare e gastrointestinale.
• Modello tridimensionale di barriera ematoencefalica. Il modello utilizzato è costituito da co-culture di cellule endoteliali e astrociti che permettono l'induzione di proprietà di barriera in cellule endoteliali non cerebrali in un sistema bi-dimensionale statico, privo del flusso presente nei capillari in condizioni fisiologiche, da cui sembra dipendere la regolazione della permeabilità dei vasi. Nei laboratori del Dipartimento di Psichiatria, Neurobiologia, Farmacologia e Biotecnologie dell'Università di Pisa abbiamo allestito un modello "in vitro" tridimensionale e dinamico di BEE, costituito dalla cocultura di cellule endoteliali e gliali in un sistema di fibre cave che riproduce fedelmente le caratteristiche della barriera "in vivo".
• Disponibilità dell'apparecchio "BIACORE" a risonanza plasmonica di superficie per lo studio delle interazioni ligando-recettore all'equilibrio, in tempo reale.
• Dosaggio dei livelli sierici di farmaci mediante tecniche di HPLC.
• Centro di eccellenza AMBISEN (ambiente e sistema endocrino e nervoso). Nell'ambito di tale centro di eccellenza disponiamo di diverse tecnologie innovative che comprendono:

1. spettrometro di massa per la determinazione di analiti e per lo studio di macromolecole proteiche,
2. apparecchiature per studi di proteomica (elettroforesi bidimensionale) e genomica (Affimetrix),
3. PET per piccoli animali,
4. modelli animali di patologie umane quali Parkinson e Alzheimer.

• Centro interdipartimentale di microscopia elettronica:  Microscopio confocale per studi dinamici in vivo su sistemi cellulari mediante probes fluorescenti.
• Centro Interdipartimentale di ricerca ‘Piaggio': Bireattori mono- e multi-compartimentali per lo studio di colture cellulari in ambiente dinamico.

Laboratorio di Fisiologia

• Equipaggiamento completo per registrazioni intracellulari con la tecnica del "patch-clamp" (amplificatori, PC dedicato, pacchetti software, microscopi, micromanipolatori, telecamera, fluorescenza, sistema perfusione, stimolatori luminosi con allineamento su banco ottico, pullers per pipette).
• Equipaggiamento completo per elettroretinografia (amplificatori, PC dedicato, pacchetti Software, stimolatori luminosi Ganzfeld).
• Laboratorio di immunoistochimica. (microscopi a fluorescenza, telecamere).

Progetti biennali di ricerca di interesse nazionale cofinanziati dal MIUR:

ANNO 2001:

• modulazione di canali ionici nei bastoncelli e nelle cellule bipolari retiniche:ruolo nella fisiologia e nel modello di retinite pigmentosa dei topi rd- Resp. Prof. Gian Carlo Demontis,
• meccanismi cellulari di danno e protezione nella retina- Resp. Prof. Luigi Cervetto,
• adenosina e recettori adenosinici : modulazioni dei meccanismi di traduzione dei segnali- Resp. Prof. Antonio Lucacchini,
• recettore A2 dell'Adenosina: regolazione da citochine e ruolo nei segnali di vita/morte cellulare nel sistema nervoso centrale- Resp. Prof.ssa Claudia Martini.

ANNO 2002:

• obesità e sistema serotoninergico in cellule circolanti - Resp. Prof. Gino Giannaccini,
• recettore periferico delle benzodiazepine: espressione, funzione e valutazione di ligandi di nuova sintesi - Resp. Prof.ssa Claudia Martini,
• farmacologia dei canali BK a livello vascolare e individuazione di nuovi BK attivatori - Resp. Prof.ssa Enrica Martinotti.         

ANNO 2003:

• ruolo dell'adenosina e delle ciclo ossigenasi nella regolazione neuromotoria delle vie  aeree in modelli sperimentali di asma- Resp. Prof.ssa  Cristina Breschi.

ANNO 2004:

• isoforme e proprietà funzionali dei canali ionici dipendenti dai nucleotidi ciclici attivati dalla  iperpolarizzazione (HCN) nella retina di mammiferi - Resp. Prof. Luigi Cervetto,
• adenosina e analoghi: meccanismi di regolazione ed eterodimerizzazione recettoriali in condizioni fisiologiche e di danno cerebrale - Resp. Prof. Antonio Lucacchini,
• ligandi di nuova sintesi al recettore periferico delle benzodiazepine:caratteristiche di legame e induzione di apoptosi in cellule tumorali - Resp. Prof.ssa Claudia Martini,
• recettori attivati dalle proteasi: accoppiamento alle proteine G e "cross-talk" delle vie trasduzionali - Resp.Prof.ssa  Maria Rosa Mazzoni,
• eterodimerizzazione e regolazione di recettori purinergici accoppiati a proteine G nei processi - Resp. Dott.ssa Letizia Trincavelli.

• Centrifuga ad alta velocità (Beckman J2-21); centrifuga refrigerata ad alta velocità (Beckman J2-HS);
• scintillatore in fase liquida (Beckman LS 1800); scintillatore in fase liquida (Packard 1600 TR); spettrofotometro Cary 13 (Varian); 
• strumentazione per colture cellulari e laboratorio di Biologia Molecolare; 
• apparecchio Biacore-X; 
• lettore di piasta Victor 2 Wallac (Perkin-Elmer); Elettroforesi bidimensionale (Amersham); Citofluorimetro (Becton Dickinson)(disponibile presso l'U.O. di Immunoematologia 2, Azienda Ospedaliera Pisana);
• sistema per lo studio di cuore isolato alla Langendorff;
• poligrafi mono- e poli-canale per la registrazione dei dati sperimentali;
• BIOPAC, per la registrazione e valutazione dei dati sperimentali;
• pompa di ventilazione per insufflazione polmonare Basile;
• elettrocardiografo Battaglia Rangoni;
• elettrocardiografo TM5000 Mindray;
• spettrofotometro NovaSpec-Plus Amersham Bioscience;
• aggregometro densitometrico ELVI 840.

• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Pisa,
• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Camerino,
• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Firenze,
• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Siena,
• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Napoli,
• Dipartimento di Scienze farmaceutiche Università di Genova,
• Dipartimento di Morfologia Umana e Biologia Applicata Università di Pisa,
• Dipartimento di Biofisica Scuola Normale Superiore di Pisa,
• Institut fur PharmaKologie und Toxikologie Universitat Wurzburg Germany,
• Institut de Chimie Thérapeutique Université de Lausanne, Switzerland,
• Dipartimento di Scienze Farmacologiche, Università di Milano,
• Fondazione Santa Lucia/CERC Roma,
• Biomedical Research Centre, Sheffield Hallam University,
• Il laboratorio di Fisiologia collabora con il Deparment of Pharmachology della Cambridge University (Medical Research Council, Cabridge, UK), con il Department of Neurobiology della Harvard Medical school di Boston (USA), con il Department of Ophthalmology, Neurobiolgy and Behavior della University of California (USA). New South Wales Retinal Distrophy Research Centre, School of Biological Sciences, Australian National University, Canberra, Australia,
• SISSA Trieste, Dipartimento di Fisiologia e Biochimica Università di Milano. Dipartimento SSTDB Università de l'Aquila.